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转膜(Transfer)
推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，上海荧光Western Blot技术服务，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟，上海荧光Western Blot技术服务。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，上海荧光Western Blot技术服务，通常会有非常严重的发热现象，比较好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量比较大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
全自动western blot无需凝胶、无需转印，放入您的样品，按个按钮，然后就没事了。首先，将样品与Simple
Western样品缓冲液混合，至终浓度1 μg/μL，还原并变性，然后将制备好的样品、一抗和二抗、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后，将Simple
Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内，它自动开展所有分析步骤。当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时，它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白，用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析**多12个样品，结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积、面积百分比和信噪比。对于传统的Western blot而言，结果的重复性一直是个挑战，因为缺乏标准化的操作，且多个操作步骤引入了实验可变性。而Simple Western分析是完全自动化的，因此结果的重复性更好。整体的定量也**改善了，因为省去了转印步骤，从而避免了蛋白转移的不一致。
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用
ECL化学发光试剂来检测蛋白。压片可以采用**的压片暗盒进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验**柯达X-OMAT BT胶片。
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