全自动western blot无需凝胶、无需转印,放入您的样品,按个按钮,然后就没事了。首先,将样品与Simple
Western样品缓冲液混合,至终浓度1 μg/μL,还原并变性,然后将制备好的样品、一抗和二抗,北京磷酸化蛋白Western Blot免疫印迹服务、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后,北京磷酸化蛋白Western Blot免疫印迹服务,将Simple
Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内,它自动开展所有分析步骤。当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时,北京磷酸化蛋白Western Blot免疫印迹服务,它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白,用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析**多12个样品,结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积、面积百分比和信噪比。对于传统的Western blot而言,结果的重复性一直是个挑战,因为缺乏标准化的操作,且多个操作步骤引入了实验可变性。而Simple Western分析是完全自动化的,因此结果的重复性更好。整体的定量也**改善了,因为省去了转印步骤,从而避免了蛋白转移的不一致。
1.为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。2.电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1~2A),通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。3.酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色。常用的HRP底物为3,3,—二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准,确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断。在**中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用
ECL化学发光试剂来检测蛋白。压片可以采用**的压片暗盒进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验**柯达X-OMAT BT胶片。
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