[VIP第1年] 指数:3
Western blotting堪称蛋白质研究中的经典方法。学生物的几乎无人不晓，即使没亲手做过，也清楚其原理。经典果然是经典，30年来其操作步骤几乎没变过，天津荧光Western Blot检测分析服务，依然是跑胶-转膜-封闭-孵育-检测。近两年，各大公司陆续推出了Western blotting方面的新仪器，如新型转印系统，确实能省时省力不少，但仍然不能完全克服研究人员在面临的挑战。Western
blotting仍存在重复性差、实验耗时长、无法准确定量等问题。
近日，美国proteinsimple公司推出了一种Simple Western™分析，彻底改变了整个Western blot。此分析在一台名为Simon的仪器上开展，Simon将所有实验步骤自动化，天津荧光Western Blot检测分析服务，天津荧光Western Blot检测分析服务，包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析，让研究人员从繁重的劳动中解放出来，同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以使用商业生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
(2) 样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳：冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，比较好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
1.为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。2.电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。3.酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在**中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。
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