[VIP第1年] 指数:3
【多色免疫组化染色样本要求】1福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA都可以，封蜡不能有明显的破损。2玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。3组织**小应包含大于1000个细胞。4蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。5组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18～24小时。6切片厚度为4μm左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。7不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、**。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。8玻片置于45°C热盘上放置30min（自然风干玻片时长不小于1小时）。【设备耗材】1检验所需设备器材：荧光显微镜、通风橱、移液器、恒温干燥箱、微波炉、计时器2检测所需耗材器皿：免疫组化笔、微波修复杯、染色缸、孵育湿盒、盖玻片、洗瓶、量筒100ml、量筒1000ml等【试剂制备】1通用试剂：DMSO、miejun去离子水、二甲苯、乙醇（全部、95%，天津多色荧光免疫组化技术服务，天津多色荧光免疫组化技术服务，天津多色荧光免疫组化技术服务、70%）、10%中性福尔马林、抗原修复液（推荐使用佰诺全景酸性或碱性抗原修复液）、一抗封闭液等。
）问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？1、非特异性染色产生原因及其解决方案：⑴游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。⑹荧光素不纯、标本固定不当等。⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至比较好。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2、阴性染色产生的原因有：⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。⑵荧光素提前衰退。
免疫细胞化学技术免疫荧光法【原理】·用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；免疫荧光技术·荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；·借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧光素·(1)异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)·(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)·(3)四乙基罗丹明(RB200)·(4)碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(1)异硫氰酸荧光素(FITC)·易溶于水和乙醇。·比较大吸收光谱为490～495nm，比较大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量。·在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上**多能标记15～20个FITC分子。(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)·比较大吸收光谱550nm，比较大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。·与蛋白质结合的方式同FITC。(3)四乙基罗丹明(RB200)·不溶于水，易溶于乙醇和**。·比较大吸收光谱为570nm，比较大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。·RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)。
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