[VIP第1年] 指数:3
中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。免疫组化实验为例从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和**终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。此外，北京五色免疫组化，我个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的高手一起分享、纠正和补充。在这里，我需要感谢中华病理网、丁香通、小木虫论坛给我很大的帮助，还有上海舜田生物技术人员老师给我实验很多指导和帮助，北京五色免疫组化，让我受益匪浅。免疫组化免疫个人感悟1，北京五色免疫组化、其实免疫组化，我个人感觉方法和操作都不是很难，关键是结果出现异常时该如何去解决？我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的。
在放入氨水中返兰即可。13）封片为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。2、免疫荧光方法中的重要环节1）冰冻切片制备建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2）组织切片固定切好片风干后立即用冰**等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3）血清封闭为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4）一抗孵育条件在免疫组化反应中**重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果比较好；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。5）二抗孵育条件二抗一般室温或37℃30min-1h。
我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。3、***，血清封闭的问题？以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作（我以前一般一抗4℃过夜且室温复温45min、二抗37℃30min、SP反应37℃30min），以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我冷静地分析了一下整个实验流程，与***次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。5、我用PBS替代一抗稀释液（我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂），其它步骤和组织切片完全与***次做出来的一致（包括血清也是老试剂盒内剩余的一点），奇迹出现了：结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是pH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的pH值，结果是前者偏酸性（<6、0），而后两者均在7、5左右。
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