[VIP第1年] 指数:3
使用包含 3 种不同浓度的 ROX 染料的预混液对 TGF-β 进行扩增。显示 (A) Ct 值和 (B) 标准差随 ROX 染料浓度的变化。降低 ROX 染料浓度导致 Ct 出现得更早，但是会增大标准差。使用 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。
Ct 随 PCR 效率发生变化。蓝色标准曲线的效率为 **（斜率为 –3.3），上海水体基因组荧光定量PCR检测服务，上海水体基因组荧光定量PCR检测服务，上海水体基因组荧光定量PCR检测服务。绿色标准曲线的效率为 78%（斜率为 –4）。与高效率条件相比（蓝色），在低效率条件下（绿色），扩增量 Y 使 Ct 出现得更早。较低扩增量 (X) 时则情况相反，与高效率条件（蓝色）相比，低效率条件（绿色）使 Ct 出现得更晚。
比较Ct值的相对定量法：此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增，可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应，并且就两者的ct值之差进行测量。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算，首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应**期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致，所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响，因此，为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化，这也是该方法应用的难点之一
PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在低效率条件下进行连续稀释扩增，与高效率条件下相比，可能会产生斜率不同的标准曲线。在图 5 中，两个样品（X 和 Y）分别在低效率和高效率条件下扩增，在靶浓度相同的条件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，尽管高效率条件（图 5 中的蓝色曲线）在高浓度时产生的 Ct 值更晚，但它在靶浓度低时却更为灵敏。PCR 效率取决于实验、预混液性能和样品质量。通常情况下，反应效率在 90-110% 之间都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如仪器、试剂和实验完全相同， 该效率也有助于得出***个样品的模板量更少的结论。然而，如果产生两个 Ct值使用的是不同的仪器、试剂、引物和探针或反应体积，该结论就不成立。因此，只有在使用上文定义的相同反应条件来比较实验时，Ct ***值的比较才有意义。
文章来源地址: http://nongye.m.chanpin818.com/nlmyxmhz/deta_3807040.html
免责声明： 本页面所展现的信息及其他相关推荐信息，均来源于其对应的用户，本网对此不承担任何保证责任。如涉及作品内容、 版权和其他问题，请及时与本网联系，我们将核实后进行删除，本网站对此声明具有最终解释权。