江苏**基因荧光定量PCR检测服务 **** 上海朝瑞生物科技供应

无论 Ct ***值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限，江苏**基因荧光定量PCR检测服务。

如前文所述，效率是决定反应灵敏度的关键因素（图 5）。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，不能预期模板为正态分布。相反，它会遵循泊松分布，该分布预测在平均包含一个拷贝的起始模板的大量重复中，江苏**基因荧光定量PCR检测服务，江苏**基因荧光定量PCR检测服务，实际上约 37% 不含拷贝，*有约 37% 含有 1 个拷贝，18% 应包含 2 个拷贝（见图 9）。因此，为了可靠地检测低拷贝，必须做大量的重复实验来提供统计***性，以克服泊松分布的限制。

RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用***反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定

  先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在低效率条件下进行连续稀释扩增，与高效率条件下相比，可能会产生斜率不同的标准曲线。在图 5 中，两个样品（X 和 Y）分别在低效率和高效率条件下扩增，在靶浓度相同的条件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，尽管高效率条件（图 5 中的蓝色曲线）在高浓度时产生的 Ct 值更晚，但它在靶浓度低时却更为灵敏。PCR 效率取决于实验、预混液性能和样品质量。通常情况下，反应效率在 90-110% 之间都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如仪器、试剂和实验完全相同， 该效率也有助于得出***个样品的模板量更少的结论。然而，如果产生两个 Ct值使用的是不同的仪器、试剂、引物和探针或反应体积，该结论就不成立。因此，只有在使用上文定义的相同反应条件来比较实验时，Ct ***值的比较才有意义。

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