向匀浆样品中加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置3-5分钟,北京9分钟完成RNA提取试剂盒****。
2-8℃ 12000 rpm离心10分钟,北京9分钟完成RNA提取试剂盒****。RNA主要在上层无色的水相中,把水相转移到新管中,不要吸到沉淀。
吸附柱前处理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液,室温放置2分钟,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀,加入吸附柱静置2分钟,2-8℃ 12000rpm离心2min,弃废液。
向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
向吸附柱中加入600ul漂洗液,北京9分钟完成RNA提取试剂盒****,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
RNA试剂盒所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品,操作过程要小心,带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯,需电泳检测。使用时一定要根据自己的实验需要购买**提取试剂盒, 如果不是**试剂盒,或许能提出RNA,但不能确保其质量以及完整性,会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克隆等后续实验的结果。
意:此步骤目的是将纯化柱中残余的漂洗液去除,离心后将纯化柱在室温放置片刻,或置于超净工作台上通风片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验操作。
将纯化柱转入一个新的离心管中,加30–100 μl RNase-free ddH2O,室温放置2 min,4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。
洗脱缓冲液体积不应少于30 μl,体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃,以防降解。
注意:如果想提高RNA得率,可重复上步操作一次,合并两次得到的溶液。
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