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免疫细胞化学技术免疫荧光法【原理】·用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；免疫荧光技术·荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；·借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧光素·(1)异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)·(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)·(3)四乙基罗丹明(RB200)·(4)碘化丙啶(propidiumiodide，上海四色免疫组化,PI)(1)异硫氰酸荧光素(FITC)·易溶于水和乙醇。·比较大吸收光谱为490～495nm，比较大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量。·在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上**多能标记15～20个FITC分子。(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)·比较大吸收光谱550nm，比较大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。·与蛋白质结合的方式同FITC。(3)四乙基罗丹明(RB200)·不溶于水，上海四色免疫组化，上海四色免疫组化，易溶于乙醇和**。·比较大吸收光谱为570nm，比较大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。·RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)。
9、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AKP），又称碱性磷酸单酯酶，是酶组织化学中**常用的酶之一。分布***，常见于活跃运输的膜上。该酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，**适pH为，可被Mg2+、Mn2+和某些氨基酸所***；**物、碘液、砷酸盐等可***其活性。显示AKP的方法很多，主要有钙钴法和同时偶联法。前者所需试剂便宜，容易购买，操作简单，但会出现假阳性。后者方法较灵敏，而且在正常组织内不存在萘酚，因此不会出现假阳性，但所需试剂较难购买。10、生物素（biotin）生物素是B族维生素之一。生物素在羧化、脱羧和转羧化反应中起辅酶作用。生物素是含硫水溶性维生素。广布于动物及植物组织，已从肝提取物和蛋黄中分离，是多种羧化酶辅基的成分。生物素标记反应简单、温和且很少***抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低，结合紧密且快速，抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。
在放入氨水中返兰即可。13）封片为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。2、免疫荧光方法中的重要环节1）冰冻切片制备建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2）组织切片固定切好片风干后立即用冰**等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3）血清封闭为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4）一抗孵育条件在免疫组化反应中**重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果比较好；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min。具体条件还要摸索。5）二抗孵育条件二抗一般室温或37℃30min-1h。
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