[VIP第1年] 指数:3
1.为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。2.电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。3.酶免疫定位，北京膜蛋白Western Blot检测服务。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量，北京膜蛋白Western Blot检测服务。本法综合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，北京膜蛋白Western Blot检测服务，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在**中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。
Western blotting堪称蛋白质研究中的经典方法。学生物的几乎无人不晓，即使没亲手做过，也清楚其原理。经典果然是经典，30年来其操作步骤几乎没变过，依然是跑胶-转膜-封闭-孵育-检测。近两年，各大公司陆续推出了Western blotting方面的新仪器，如新型转印系统，确实能省时省力不少，但仍然不能完全克服研究人员在面临的挑战。Western
blotting仍存在重复性差、实验耗时长、无法准确定量等问题。
近日，美国proteinsimple公司推出了一种Simple Western™分析，彻底改变了整个Western blot。此分析在一台名为Simon的仪器上开展，Simon将所有实验步骤自动化，包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析，让研究人员从繁重的劳动中解放出来，同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用
ECL化学发光试剂来检测蛋白。压片可以采用**的压片暗盒进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验**柯达X-OMAT BT胶片。
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