[VIP第1年] 指数:3
全自动western blot无需凝胶、无需转印，放入您的样品，按个按钮，然后就没事了。首先，将样品与Simple
Western样品缓冲液混合，至终浓度1 μg/μL，还原并变性，然后将制备好的样品、一抗和二抗、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后，将Simple
Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内，它自动开展所有分析步骤。当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时，它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白，用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析**多12个样品，结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积，上海膜蛋白Western Blot检测服务、面积百分比和信噪比。对于传统的Western blot而言，结果的重复性一直是个挑战，因为缺乏标准化的操作，且多个操作步骤引入了实验可变性，上海膜蛋白Western Blot检测服务，上海膜蛋白Western Blot检测服务。而Simple Western分析是完全自动化的，因此结果的重复性更好。整体的定量也**改善了，因为省去了转印步骤，从而避免了蛋白转移的不一致。
免疫印迹法（immunoblotting ）因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern
blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用**的免疫化学方法之一。
1.为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。2.电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。3.酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在**中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。
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