[VIP第1年] 指数:3
具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间，北京多色荧光免疫组化检测服务。***，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6）复染目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位，北京多色荧光免疫组化检测服务。一般常用DAPI复染。7）封片为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡，北京多色荧光免疫组化检测服务。8）切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：⑴单独冲洗，防止交叉反应造成污染。⑵温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；⑶冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。⑷PBS的PH和离子强度的使用和要求。
在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5－10%正常羊血清，这一步可以省略。）6.缓冲液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。（具体孵育时间和温度由试验者**终决定）8.缓冲液洗5min/2次。9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。10．缓冲液洗5min/2次。11．滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。（注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）12．缓冲液洗5min/2次。13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。（具体时间由染色深浅决定。）14．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化操作步骤⑴、石蜡切片脱蜡至水。⑵、3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后进行）。⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。⑸、PBS冲洗，5分钟x3次。
使许多疑难**得到了明确诊断。在常规**病理诊断中，5%-10%的病例单靠。尤其是免疫组化在**诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化**的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：⑴恶性**的诊断与鉴别诊断；⑵确定转移性恶性**的原发部位；⑶对某类**进行进一步的病理分型；⑷软组织**的***一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织**的诊断是不可缺少的；⑸发现微小转移灶，有助于临床***方案的确定，包括手术范围的确定。⑹为临床提供***方案的选择。免疫组化免疫组化镜检在镜检前可以通过相关资料查询抗体的表达部位：细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核以及在其中的多个部位表达（如：MPO抗体表达在细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核上）和表达组织（如：VWF抗体在血管壁上表达，呈现环形）。在显微镜下观察时，先在4倍镜下查找组织及其范围，然后查看整个组织确定阳性产物的表达部位，然后将阳性产物表达部位置于视野正**，换高倍镜观察。
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