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温度设置：在设置荧光 PCR 程序时，要仔细核对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数，参数设置不正确将直接影响 PCR 检测结果，上海荧光定量PCR技术服务。延伸过程中要设置读取收集荧光信号，如不设置收集荧光，将无法保存试验数据，上海荧光定量PCR技术服务，无法判定检测结果，造成试验失败 操作规范：在对样品进行核酸提取和实时荧光扩增时要规范操作，防止样品的交叉污染、 酶的降解、假阳性的出现 离心管、***头和 PCR 管均需要高压灭菌或使用商品化的无 污染的离心管、***头和PCR 管，上海荧光定量PCR技术服务。核酸提取结束后应立即进行仪器扩增，提取的核酸不可长时间置于室温，易受空气中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，长期应保存于－70 ℃冰箱
Ct（阈值循环）是扩增曲线与阈值线的交叉点（图 1B）。它是 PCR 反应中靶标浓度的相对测量。除靶标浓度之外，还有很多因素会影响 Ct 的***值。我们将要讨论最常见的可能影响 Ct 值的非模板依赖性因素，并描述如何评估实时荧光定量 PCR 反应的性能。
显示实时反应扩增图的几个参数。图 1B 中的**期对应于图 1C 中的线性期。阈值必须设在扩增图的线性期中。Ct 值随模板量减少而增加。然而，反应混合物或仪器中的任何干扰，只要能影响与 Ct 计算相关的荧光测定，都会使 Ct 值产生非模板依赖性的变化。因此，在不同条件下或用不同试剂进行的 PCR 反应产生的 Ct 值不可以直接进行比较。
为了正确地评估 PCR 效率，至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由，它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时，获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此，即使检测 ** 有效，由于每个稀释点都存在标准差，检测一个数量级倍数的连续稀释时，可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复，可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内，如果效率为 94%，则该实验的效率范围介于 88% 到 ** 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率，必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 ** ±±10%。PCR 反应效率越低，那么灵敏度越低。
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