江苏多色荧光免疫组化 **** 上海朝瑞生物科技供应

    免疫细胞化学技术免疫荧光法【原理】·用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；免疫荧光技术·荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；·借助于荧光显微镜进行观察。1，江苏多色荧光免疫组化、常用的荧光素·(1)异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)·(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC)·(3)四乙基罗丹明(RB200)·(4)碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(1)异硫氰酸荧光素(FITC)·易溶于水和乙醇。·比较大吸收光谱为490～495nm，比较大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量。·在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上**多能标记15～20个FITC分子。(2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)·比较大吸收光谱550nm，比较大发射光谱620nm，呈红色荧光，江苏多色荧光免疫组化，分子量为444。·与蛋白质结合的方式同FITC。(3)四乙基罗丹明(RB200)·不溶于水，易溶于乙醇和**。·比较大吸收光谱为570nm，比较大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，江苏多色荧光免疫组化，分子量为580。·RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)。江苏多色荧光免疫组化

    在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5－10%正常羊血清，这一步可以省略。）6.缓冲液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。（具体孵育时间和温度由试验者**终决定）8.缓冲液洗5min/2次。9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。10．缓冲液洗5min/2次。11．滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。（注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）12．缓冲液洗5min/2次。13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。（具体时间由染色深浅决定。）14．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化操作步骤⑴、石蜡切片脱蜡至水。⑵、3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后进行）。⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。⑸、PBS冲洗，5分钟x3次。江苏多色荧光免疫组化

    ）问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？1、非特异性染色产生原因及其解决方案：⑴游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。⑹荧光素不纯、标本固定不当等。⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至比较好。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2、阴性染色产生的原因有：⑴一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。⑵荧光素提前衰退。

    [1]免疫组化分类编辑免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。这些常用免疫组织化学方法的原理如下：1.免疫荧光细胞化学技术将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.2.免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学研究中**常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．3.免疫胶体金技术就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究．[1]免疫组化作用编辑免疫组化标本实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

    收藏查看我的收藏0有用+1已投票0免疫组织化学技术编辑锁定免疫组织化学技术又称为免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗原或抗体在组织细胞原位通过抗原抗体的免疫反应和组织化学的呈色反应，对相应的抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的一项免疫学检测方法。中文名免疫组织化学技术外文名Immunohistochemistrytechnique目录1发展简史2现状与展望免疫组织化学技术发展简史编辑免疫荧光组织化学是现***物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光***细胞分类器Fluorescinactivatedcellsorter（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。江苏六色免疫组化分析服务

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