[VIP第1年] 指数:3
这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议pH在。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9）拍照有条件的话比较好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以**多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，北京六色免疫组化检测服务，须待灯光充分冷却后才能点燃，北京六色免疫组化检测服务。***中应避免数次点燃光源，北京六色免疫组化检测服务。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
⑴抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。⑵石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。⑶组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。⑴一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。⑵抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。⑶抗体浓度过低。这是阴性结果的**可能原因。必须提高稀释度。
是分泌性蛋白检测优先方法之一。下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。实验流程简介一、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。2)（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（比较好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。8)PBS冲洗，3分钟×5次。9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。11）显色剂显色（DAB等）。12）自来水充分冲洗。13）可进行复染，脱水，透明。14）选择适当的封片剂封片。二、即用型二步法1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3)，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
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