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免疫组织化学是一项在医学基础与临床科研中被广泛应用的一项技术，免疫组化染色服务也是生物公司的一项常规服务之一。该技术融合了抗原和抗体特异性结合的免疫学技术与组织学技术，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来对组织或细胞内抗原进行定位和定量研究。肽类、***、神经递质、细胞因子，江苏五色免疫组化分析服务、受体、表面抗原等，它们的组织细胞内具有抗原性的物质，所以均可以用免疫组织化学方法显示。免疫组化常用的显色剂包括荧光素、酶、生物素和铁蛋白等。11、金属离子和金属蛋白复合物
金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可以作为免疫组化反应中的标记物。如铁蛋白等，主要应用于免疫电镜。免疫金银法的基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或SPA蛋白，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片、冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片。这种方法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确，江苏五色免疫组化分析服务、无扩散现象且背景清洗，江苏五色免疫组化分析服务，对比度好、方法简便。 江苏五色免疫组化分析服务
其中石蜡切片是制作组织标本**常用、**基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中优先的组织标本制作方法。免疫组化抗体免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。免疫组化常用染色方法根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法**常用。免疫组化操作步骤编辑一免疫组化（SP法）操作步骤1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行2.缓冲液洗3min/2次。3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分钟。4.缓冲液洗5min/2次。5.滴加UltraVBlock。上海多靶点免疫组化技术服务
免疫组化染色常用于的标记物。1、异硫氰酸荧光素（FITC）FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质较为常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色，其缺点是在光照下容易淬灭，易受自发荧光影响。比较大激发光波长为490nm；比较大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法。美迪西提供免疫组化染色服务，其生物部在体外生物学领域有丰富***的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。2、四乙基罗丹明（RB200）RB200能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和**，性质稳定，可长期保存，***应用于双标记示踪染色。比较大激发光波长为570nm，比较大发射光波长为595-600nm，荧光显微镜下发橙红色荧光。
⑴抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。⑵石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。⑶组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。⑴一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。⑵抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。⑶抗体浓度过低。这是阴性结果的**可能原因。必须提高稀释度。
在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5－10%正常羊血清，这一步可以省略。）6.缓冲液洗5min/2次。7.滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。（具体孵育时间和温度由试验者**终决定）8.缓冲液洗5min/2次。9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。10．缓冲液洗5min/2次。11．滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。（注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）12．缓冲液洗5min/2次。13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。（具体时间由染色深浅决定。）14．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化操作步骤⑴、石蜡切片脱蜡至水。⑵、3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后进行）。⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。⑸、PBS冲洗，5分钟x3次。江苏七色免疫组化分析服务
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免疫细胞化学技术抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。免疫细胞化学技术抗原(antigen,Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。·免疫原性**强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和***等。·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。江苏五色免疫组化分析服务
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