北京MiRNA 荧光定量PCR课题承包 **** 上海朝瑞生物科技供应

荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，北京MiRNA 荧光定量PCR课题承包。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线

Ct值：C**Cycle，北京MiRNA 荧光定量PCR课题承包，北京MiRNA 荧光定量PCR课题承包，t**threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数

荧光背景信号阶段：在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化 北京MiRNA 荧光定量PCR课题承包

用于病原体检测：常规PCR不能定量，在操作中易污染导致出现假阳性结果，应用实时荧光定量PCR技术可以解决这些问题。此项技术已应用于检测丙肝***、宫颈*及其*前病变有关的人类**瘤***、抗结核******后定量检测病人痰样本病原体DNA含量，为疾病的诊断和***提供依据。用此项技术还可以一次性检测大量大肠杆菌样本，简便准确，是食品检面的一个突破 

用于***选择和疗效判断：化疗过程中主要问题是病人对化疗***的耐药，检测**耐药基因的表达水平是选择化疗***的依据。检测微小残留病变的变化情况对于调整***策略和对病人进行个体化***非常重要 北京lncRNA荧光定量PCR检测服务

温度设置：在设置荧光 PCR 程序时，要仔细核对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数，参数设置不正确将直接影响 PCR 检测结果。延伸过程中要设置读取收集荧光信号，如不设置收集荧光，将无法保存试验数据，无法判定检测结果，造成试验失败 操作规范：在对样品进行核酸提取和实时荧光扩增时要规范操作，防止样品的交叉污染、 酶的降解、假阳性的出现 离心管、***头和 PCR 管均需要高压灭菌或使用商品化的无 污染的离心管、***头和PCR 管。核酸提取结束后应立即进行仪器扩增，提取的核酸不可长时间置于室温，易受空气中酶的降解，短期可保存于 －20 ℃冰箱，长期应保存于－70 ℃冰箱 

荧光定量PCR 实验步骤（1） 

样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②每样品加入1ml的TRIZOL试剂裂解，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用移液器反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

使用可高压处理的移液器，由于移液器容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，因此要使用可高压处理的移液器 。严格按照试验的分区进行操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，物品、样品和试剂不可逆向流动 。操作多份样品时，制备反应混合液，先将荧光 PCR 反应液、荧光探针和酶混合好，然后分装到每个 PCR 管中，这样即可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精确度 。加样品、加蛋白酶 K 和加样品过程中，特别注意防止样品的交叉污染和酶的降解   。操作时设立阴性及阳性对照，可验证荧光 PCR反应的准确性和可信性北京基因突变荧光定量PCR实验技术服务

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