[VIP第1年] 指数:3
荧光定量PCR 实验步骤（1）
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②每样品加入1ml的TRIZOL试剂裂解，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟，天津siRNA荧光定量PCR技术服务。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，天津siRNA荧光定量PCR技术服务，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，天津siRNA荧光定量PCR技术服务，先加入无RNA酶的水40μl用移液器反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 天津siRNA荧光定量PCR技术服务
用于病原体检测：常规PCR不能定量，在操作中易污染导致出现假阳性结果，应用实时荧光定量PCR技术可以解决这些问题。此项技术已应用于检测丙肝***、宫颈*及其*前病变有关的人类**瘤***、抗结核******后定量检测病人痰样本病原体DNA含量，为疾病的诊断和***提供依据。用此项技术还可以一次性检测大量大肠杆菌样本，简便准确，是食品检面的一个突破
用于***选择和疗效判断：化疗过程中主要问题是病人对化疗***的耐药，检测**耐药基因的表达水平是选择化疗***的依据。检测微小残留病变的变化情况对于调整***策略和对病人进行个体化***非常重要 北京临床疾病荧光定量PCR分析服务
产生的 ΔRn 值也不同。请注意，荧光信号基线属于非模板依赖性因素，两种预混液的基线是不同的（图 3A）。Ct 值的变化并没有反映出反应系统的整体性能（图 3B）。灵敏度相当的预混液产生的 Ct ***值可能不同。
使用预混液 A 和预混液 B 在等量的人类 gDNA 中进行 RNase P 扩增。(A) Rn 根据循环数进行绘制，并且显示两个反应的基线。(B) 对数 (ΔRn) 根据循环数进行绘制。两种预混液的阈值（绿线）设定为相同水平。对于相同浓度的靶标而言，预混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于预混液 A 的相应值 (CtA)，表明预混液 B 的基线较低。使用 Applied Biosystems™ 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。
荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)， 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记**PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度 [1] 。
荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍
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PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在低效率条件下进行连续稀释扩增，与高效率条件下相比，可能会产生斜率不同的标准曲线。在图 5 中，两个样品（X 和 Y）分别在低效率和高效率条件下扩增，在靶浓度相同的条件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，尽管高效率条件（图 5 中的蓝色曲线）在高浓度时产生的 Ct 值更晚，但它在靶浓度低时却更为灵敏。PCR 效率取决于实验、预混液性能和样品质量。通常情况下，反应效率在 90-110% 之间都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如仪器、试剂和实验完全相同， 该效率也有助于得出***个样品的模板量更少的结论。然而，如果产生两个 Ct值使用的是不同的仪器、试剂、引物和探针或反应体积，该结论就不成立。因此，只有在使用上文定义的相同反应条件来比较实验时，Ct ***值的比较才有意义。天津siRNA荧光定量PCR技术服务
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