[VIP第1年] 指数:3
有关转基因及其产品的安全性的争论在国内外愈演愈烈，各国**纷纷出台一系列的政策、法规，要求对转基因作物进行标识，有些国家对转基因的比较低含量做了限定，其阈值大小从1-5％不等。这就要求必须对转基因及其产品进行检测。 常规的检测方法多采用PCR法，如PCR-凝胶电泳、PCR-ELISA等。这些方法普遍存在着PCR产物污染、特异性不高及速度慢等问题。荧光PCR技术是一种新近发展起来的检测技术，它的应用将从根本上解决这些问题。 1.收集了国内外商品化的转基因作物品种，并通过查阅有关文献及网站初步确定了各种作物的转基因构建图； 2．于反应体系中引入UNG去污染酶，建立了无污染荧光PCR扩增体系； 3．以植物内源基因18SrRNA为靶标，设计了特异性引物和荧光探针，建立了以18SrRNA基因的扩增与否来判断核酸提取质量好坏的方法； 4．以FAM荧光素为标记，北京病原微生物荧光定量PCR技术服务，建立了以35S，北京病原微生物荧光定量PCR技术服务、NOS、NPTⅡ、Pat、Bar，北京病原微生物荧光定量PCR技术服务、FMV和CryⅢa为筛选目标的转基因农作物荧光PCR定性检测体系； 5．分别以FAM和TET两种荧光素标记外源基因和内源基因，建立了转基因大豆及转基因玉米的荧光定量PCR检测体系。北京病原微生物荧光定量PCR技术服务
Rn 值是由 Applied Biosystems™ FAM™ 染料的荧光除以 ROX 染料的荧光而计算得出的比率。因此，假定 FAM 染料产生的荧光信号保持不变，ROX 染料量越少，产生的 Rn 值就越高。这将导致 Rn 基线上升，以及随后 ΔRn 的减少和 Ct 值的变化。通过降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，没有对反应的真实灵敏度产生任何影响，却有着意想不到的后果。如图 4 所示，降低 ROX 染料的浓度可能会增加 Ct 值的标准差。标准差越大，分辨靶浓度之间的细微区别的可信度就越低（参加下文的精确度一节）。北京**基因荧光定量PCR实验技术服务
在分子生物学领域的研究应用
用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析：人们对疾病的易感性和对同一种******同一种疾病的效果是有差异性的，遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP是个体差异的遗传基础。SNP在人类基因组中***存在，是人类可遗传变异中最常见的一种，在遗传性疾病的研究中具有重要意义
DNA甲基化检测：DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息，通过实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义
在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号**扩增阶段任意位置上，但一般荧光阈值的设置是PCR反应**-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。
在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法：***定量和相对定量。***定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化
相对定量：相对定量法又分为两种
比较标准曲线的相对定量法：在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法为相对定量法。在采用该方法过程中，需要有参照物，所以较容易绘制定量标准曲线，只要将标准品稀释度确定便可进行对比分析 天津siRNA荧光定量PCR分析服务
北京病原微生物荧光定量PCR技术服务
管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。
PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 北京病原微生物荧光定量PCR技术服务
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