[VIP第1年] 指数:3
RNA 常用提取方法（1）
1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法:
原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效制抑RN A 酶的活性，经过起始密度为1.78g/m l 的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA ，而且能同时分离出细胞染色体DNA。
2、盐酸胍-有机溶剂法：
原理：本法有MacDonald1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍制抑RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质,通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。
3，北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498，北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498，北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498、氯化锂-尿素法：
原理：本法首先由Auffray报道,利用高浓度尿素变性蛋白质同时制抑RNA酶，3 mol/L LiCl选择性沉淀RNA。
或许能提出RNA，但不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR。北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498
细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，由于rRNA占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA，它也有三种类型：28S，18S，5S三条带，在RNA的提取时，一定要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压无菌15分钟.但对于无菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,，可以不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。 北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498使用时无需配制其它试剂，非常方便，适合于RNA的快速提取。
RNA提取注意事项（5）
纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀（加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇，-20°C放置25分钟以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉剂是linear acrylamide，当RNA用于RT-PCR分析时，线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂，因为它们都不含DNA污染，糖原含量高会制抑PCR反应。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染，有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后，注意避免RNA沉淀过分干燥，因为这可能导致很难重新溶解。
可选步骤： 4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase 的离心管中。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
加入200 μl 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。
4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 离心10 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA 主要在水相中，水相的体积约为所用溶液 RL试剂的60%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。***次使用前应在溶液 RPI、溶液 RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。 将吸附柱放入新管中，向膜**滴加50-100ul RNase free ddH2O。
通用RNA提取试剂盒是经过改进开发的新一代产品，提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度，同时通过可在特定适宜的条件下特异、可逆地结合RNA，而各种蛋白质和其他杂质均可被去除掉对硅基质膜的改进增强了对RNA的吸附能力，得到的RNA 纯度更好，质量更高。该试剂盒可从各种细胞或组织中快速提取总RNA，每个吸附柱每次可处理50–100 mg 组织或5×106 细胞，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA 没有DNA 和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆。离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498
向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8 12,000 rpm ℃ 离心2min，弃废液。北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498
样品匀浆后，加入氯仿前，可在-80°C 冻存放置一个月。
RNA 沉淀可以保存在 75%乙醇中，2-8°C 放置一周或-20°C 放置一年。
该试剂盒***于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断或***，更不得用于食品或药品中。
实验步骤、细胞裂解或组织匀浆：
a贴壁细胞：吸尽培液，按照比例加入 Trizol 消化细胞，即每 10 平方厘米细胞中加入 1 ml Trizol，六孔板每孔加 1 ml Trizol，12 孔板每孔加 0.5 ml Trizol。晃动 3-5 下，再用移液器反复吹打几下，确保细胞全部裂解，然后将溶液转移至离心管中。【注】加入 Trizol 量不足时，会导致 DNA 污染。 北京 RNA提取试剂盒QQ 804036498
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